1953年的美国，社会对女性的期待如同沃森女子学院的常春藤，规整而刻板。凯瑟琳·沃森，一位从加州大学洛杉矶分校毕业的年轻艺术史教师，带着对教育的热情和对自由的向往，走进了这所保守的精英学府。她面对的，是一群即将毕业、被教导“好婚姻胜过好成绩”的女生。她们精通社交礼仪，熟记家政课程，却对画布背后灵魂的呐喊视而不见。
凯瑟琳的课堂，从一幅《蒙娜丽莎的微笑》开始。她引导学生们去观察，去质疑：蒙娜丽莎为何微笑？她是否真的快乐？这幅画背后，是否隐藏着女性被凝视、被定义的命运？学生们起初不解，她们习惯了标准答案，习惯了将画作解读为“完美的女性形象”。但凯瑟琳坚持让她们看到，达芬奇笔下的微笑，或许是一种对沉默的接受，一种对自身处境的无奈妥协。
这种对传统艺术解读的颠覆，迅速演变为对现实生活的挑战。贝蒂·沃伦，一个成绩优异、出身名门的女孩，坚信婚姻是女性价值的最高体现。她按照母亲的期望，早早订婚，却在新婚之夜发现丈夫的冷漠与自私。她试图用完美的微笑掩盖痛苦，如同画中的蒙娜丽莎。而乔安·布兰德，一个渴望成为律师的女生，却因社会偏见而放弃梦想，最终选择结婚。她们都在“传统束缚”的框架内，试图寻找自我，却一次次撞得头破血流。
凯瑟琳没有直接告诉她们该怎么做。她只是不断抛出问题：女性的价值，是否只能由婚姻和家庭来定义？当你们成为妻子和母亲之后，你们自己，那个独立的灵魂，又去了哪里？她鼓励学生们去阅读、去思考、去创作，去发现艺术中那些被压抑的女性声音。她带她们看莫奈的《睡莲》，看梵高的《星月夜》，让她们明白，真正的美，源于内心的自由与表达。
电影的高潮，是贝蒂在经历婚姻失败后，终于撕下伪装，向母亲和同学坦白自己的痛苦。她不再扮演那个完美的沃森女孩，而是选择直面真实的自我。她开始重新审视那幅《蒙娜丽莎的微笑》，她意识到，蒙娜丽莎的微笑，不是对命运的顺从，而是一种对沉默的反抗。她决定离开丈夫，去纽约学习艺术，去寻找属于自己的未来。
凯瑟琳最终离开了沃森学院，继续她的旅程。但她留下的，是女性觉醒的种子。那些曾经被传统束缚的年轻女性，开始意识到，她们的价值，不取决于是否拥有完美的婚姻，而在于能否勇敢地成为自己。正如电影的片名，蒙娜丽莎的微笑，不再是一个谜，而是一种力量——一种敢于打破沉默、追寻自我价值的力量。